Das „New Coronary Virus Pneumonia Diagnosis and Treatment Program (Trial Ninth Edition)“ verwendet den Nukleinsäurenachweis-Ct-Wert ≥35 als eine der wichtigen Grundlagen für die Freigabe, das Isolationsmanagement oder die Entlassung. Was stellt also der Ct-Wert des Nukleinsäure-Nachweiskits dar? Sind die Ct-Werte verschiedener Kits vergleichbar? Ist die Leistung des Kits umso besser, je niedriger der Ct-Wert ist?
Der Ct-Wert (Threshold Cycle, Ct) ist die Anzahl der PCR-Zyklen, wenn die Intensität des quantitativen Fluoreszenzsignals in Echtzeit den festgelegten Schwellenwert überschreitet. Nukleinsäure-Nachweiskits nehmen die neue Krone als Beispiel. Für die gleiche Reaktion des gleichen Kits zum Nachweis von zwei virushaltigen Proben, A und B, repräsentiert die Größe des Ct-Werts in gewissem Maße die Anzahl der Kopien des viralen Gens, d. h. die Viruslast. Je niedriger der Ct von Probe B, desto höher ist die Viruslast. Der Ct-Wert ist umgekehrt proportional zur Viruslast und ihrer Infektiosität. Die Vor- und Nachteile verschiedener quantitativer Echtzeit-Fluoreszenz-Kits können nicht allein anhand der Größe des Ct-Werts beurteilt werden, da die Ct-Werte verschiedener Kits nicht vergleichbar sind. Die Leistungsbewertung des Kits muss anhand der Aspekte Sensitivität (minimale Nachweisgrenze), Spezifität, Präzision, Stabilität und diagnostische Anwendung erfolgen. Jeder Reagenzienhersteller hat seine eigenen achtzehn Arten von Kampfkünsten und sie haben ihre eigenen magischen Kräfte in der Anwendung, daher werde ich hier nicht auf Details eingehen.
Bei herkömmlichen quantitativen Echtzeit-PCR (QPCR)-Analysegeräten/-systemen ist die Erfassung von Ct-Werten und deren weitverbreiteter Einsatz in Anwendungen zur Erkennung von Krankheitserregern jedem bekannt. Mit der Entwicklung der Branche und dem Fortschritt der Technologie sind QPCR-Geräte und -Reagenzien auf Chancen und Herausforderungen gestoßen. Yiou Think Tank (2021 Research Report on China’s Genetic Testing Industry: Technology) analysierte, dass die meisten Unternehmen in der QPCR-Branche meines Landes mit gemeinsamen Problemen aufgrund der Technologie konfrontiert sind. Als Reaktion auf diese Probleme werden die Lösungen hauptsächlich in zwei Arten unterteilt: Beschleunigung der Technologieverbesserung und Einsatz neuer Technologien.
POCT für die molekulare QPCR-Diagnose ist eine der Entwicklungsrichtungen der Branche, und die Verbesserung der Leistung ist ein wichtiger Faktor, um die Anwendung der Technologie zu beschleunigen. Wie kann bei POCT-Geräten mit Einzelprobendurchsatz von QPCR der Ct-Wert des Schlüsselparameters einer einzelnen Reaktion in Forschung und Entwicklung optimiert werden? Bei gleicher Ausrüstung, gleichem Reaktionssystem und gleicher Templatkonzentration ist theoretisch die Effizienz des Enzyms in der Reaktion umso geringer, je größer der Ct-Wert einer einzelnen Reaktion ist.
Im Prozess der Verbesserung der Effizienz der Enzymreaktion und der Optimierung des Ct-Werts kann zunächst eine typische quantitative Fluoreszenzamplifikationskurve für 40 PCR-Zyklen analysiert werden. Die Verstärkungskurve in der Abbildung unten ist in Fluoreszenzhintergrundphase, exponentielle Verstärkungsphase, lineare Phase und Plateauphase unterteilt. Um einen niedrigeren Fluoreszenzhintergrund zu erreichen und ihn so weit wie möglich vom Fluoreszenzwert der frühen exponentiellen Amplifikation zu unterscheiden, ist es notwendig, Tests anhand des Reaktionsverbrauchsträgers, des Primer-Sonden-Design-Screenings und des Reaktionspuffersystems durchzuführen. Die exponentielle Amplifikationsperiode ist die direkteste Reaktion der Enzymaktivität und auch der Beweis für die perfekte Koordination von POCT-Geräten, Reaktionsträgern und Reagenzien. Zu diesem Zeitpunkt müssen die Temperaturregelung der Geräte, die Erfassung und Analyse optischer Signale, die Trägerbiokompatibilität und die Systemleistung der Reagenzien in allen Aspekten angepasst und getestet werden. Schließlich ist die gesamte Amplifikation abgeschlossen und die Ergebnisse müssen durch einen strengen Datenalgorithmus dargestellt werden, um einen angemessenen Ct-Wert zu erhalten.

Ein kleiner Schritt zur Optimierung des Ct-Wertes sind die unzähligen Schritte des F&E-Personals. In der Angst und Aufregung des Tages und der Nacht, jedes Mal, wenn „die Berge und Flüsse nirgends zu sehen sind, die Weiden dunkel und die Blumen hell sind und da ein anderes Dorf ist“, gibt uns das den Mut und die Leidenschaft, weiterzumachen wieder.