O “Programa de Diagnóstico e Tratamento de Pneumonia por Vírus Coronariano (Nona Edição de Teste)” usa o valor Ct de detecção de ácido nucleico ≥35 como uma das bases importantes para a liberação do gerenciamento de isolamento ou alta. Então, o que representa o valor Ct do kit de detecção de ácido nucleico? Os valores Ct de diferentes kits são comparáveis? Quanto menor o valor de Ct, melhor será o desempenho do kit?
O valor Ct (Ciclo Limiar, Ct) é o número de ciclos de PCR quando a intensidade do sinal de fluorescência quantitativa de fluorescência em tempo real excede o limite definido. Os kits de detecção de ácido nucleico tomam a nova coroa como exemplo. Para a mesma reação do mesmo kit para detectar duas amostras contendo vírus, A e B, o tamanho do valor Ct representa, até certo ponto, o número de cópias do gene viral, ou seja, a carga viral. Quanto menor for o Ct da amostra B, maior será a carga viral. O valor Ct é inversamente proporcional à carga viral e à sua infecciosidade. Os prós e contras de diferentes kits quantitativos de fluorescência em tempo real não podem ser julgados apenas pelo tamanho do valor Ct, porque os valores Ct de diferentes kits não são comparáveis. A avaliação de desempenho do kit precisa ser medida a partir dos aspectos de sensibilidade (limite mínimo de detecção), especificidade, precisão, estabilidade e aplicação diagnóstica. Cada fabricante de reagentes tem seus próprios dezoito tipos de artes marciais, e eles têm seus próprios poderes mágicos em aplicação, então não entrarei em detalhes aqui.
Para instrumentos/sistemas convencionais de análise quantitativa de PCR em tempo real (QPCR), a aquisição de valores de Ct e seu uso generalizado em aplicações de detecção de patógenos são familiares a todos. Com o desenvolvimento da indústria e o avanço da tecnologia, os equipamentos e reagentes QPCR encontraram oportunidades e desafios. Yiou Think Tank (Relatório de Pesquisa de 2021 sobre a Indústria de Testes Genéticos da China: Tecnologia) analisou que a maioria das empresas da indústria de QPCR do meu país está enfrentando problemas comuns com base na tecnologia. Em resposta a estes problemas, as soluções são divididas principalmente em dois tipos: aceleração da melhoria tecnológica e implantação de novas tecnologias.
POCT para diagnóstico molecular QPCR é uma das direções de desenvolvimento da indústria, e a melhoria do desempenho é um fator importante para acelerar a aplicação da tecnologia. Para equipamentos POCT com rendimento de amostra única de QPCR, como otimizar o valor Ct do parâmetro chave de uma única reação em P&D? O mesmo equipamento, o mesmo sistema de reação e a mesma concentração de molde, teoricamente quanto maior o valor de Ct de uma única reação, menor será a eficiência da enzima na reação.
No processo de melhoria da eficiência da reação enzimática e otimização do valor Ct, uma curva típica de amplificação quantitativa de fluorescência de 40 ciclos de PCR pode ser analisada primeiro. A curva de amplificação na figura abaixo é dividida em fase de fundo de fluorescência, fase de amplificação exponencial, fase linear e fase de platô. A fim de obter um fundo de fluorescência mais baixo, na medida do possível para distingui-lo do valor de fluorescência da amplificação exponencial inicial, é necessário testar o transportador de consumíveis de reação, a triagem do projeto da sonda de primer e o sistema tampão de reação. O período de amplificação exponencial é a reação mais direta da atividade enzimática, e também é a prova da perfeita coordenação do equipamento POCT, transportadores de reação e reagentes. Neste momento, o controle de temperatura do equipamento, a aquisição e análise de sinais ópticos, a biocompatibilidade do transportador e o desempenho do sistema dos reagentes precisam ser ajustados e testados em todos os aspectos. Finalmente, toda a amplificação é concluída e os resultados devem ser apresentados por um algoritmo de dados rigoroso para obter um valor Ct razoável.
Um pequeno passo na otimização do valor Ct são as inúmeras etapas do pessoal de P&D. Na ansiedade e excitação do dia e da noite, cada vez que “as montanhas e os rios não se vêem em lado nenhum, os salgueiros são escuros e as flores são brilhantes e há outra aldeia”, o que nos dá coragem e paixão para seguir em frente de novo.
Horário da postagem: 29 de setembro de 2022
Horário da postagem: 20/11/2023 16:50:46